Neue Methoden für das Labor

Das Labor von Asifa Akhtar veröffentlicht mit CAPRI und MAPCap neue Technologien zur Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen und Transkriptionsstartstellen.

30. Juli 2019

  1. CAPRI zur Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen
  2. MAPCap und Icetea zur Untersuchung von Transkriptionsstartstellen

MIt CAPRI einen Blick auf RNA-Protein-Interaktionen werfen: Neue Technik zur Untersuchung von RNA-Bindungsproteinen bei Drosophila und Mensch

RNA-Protein-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression. Forscher am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik (MPI-IE) in Freiburg haben nun eine Reihe von innovativen Workflows zum umfangreichen Charakterisierung dieser RNA-Protein-Interaktionen entwickelt. Die Methode ermöglicht eine bisher noch nicht gekannte Auflösung für das Studium des Interaktoms, die von komplexen Proteinstrukturen, die direkt oder indirekt an die RNA binden, bis hin zu einzelnen Aminosäuren reich. Die Technik mit dem Namen “CAPRI” für Crosslinked and Adjacent Peptides-based RNA-binding domain Identification wurde im Labor von Max-Planck-Direktorin Asifa Akhtar entwickelt und hat weitreichende Anwendungen in Biologie und Medizin.

Nachdem praktisch alle drei Milliarden DNA-Basenpaare im menschlichen Genom kartiert wurden, hat sich der Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung verlagert. Mittlerweile wächst das Interesse daran, diese genetische Informationen nicht nur zu kennen, sondern auch zu verstehen, wie sie reguliert wird. Dabei steht vor allem die Rolle der RNA im Mittelpunkt, um besser zu verstehen, wie unsere Gene kontrolliert werden. Denn RNA-Moleküle, meist bekannt als Messenger-RNA (mRNA), sind nicht nur bloße Vermittler, die eine Gensequenz von der DNA zur Proteinfabrik übertragen, sondern auch wichtige Akteure bei vielen verschiedenen zellulären Prozessen.

„RNA-Moleküle arbeiten dabei mit einer Vielzahl spezifischer Eiweiße zusammen, die bestimmte Bereiche der RNA verstecken oder freilegen. Auf diese Weise übernehmen diese RNA-Protein-Komplexe wichtigen funktionelle Aufgaben innerhalb Zelle und spielen eine bedeutende Rolle bei der Genregulation, der Entwicklung der Zelle, dem Stoffwechsel und sogar bei Krankheiten“, sagt Asifa Akhtar, Direktor am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (MPI-IE). Von den etwa 25.000 Proteinen, die vom menschlichen Genom kodiert werden, bilden fast 10% eine Untergruppe von sogenannten RNA-bindenden Proteinen (RBP), die mit allen Arten von RNA interagieren können und so die verschiedenen RNA-Funktionen koordinieren.

Schälen aller Regulatorschichten auf einmal 

In ihrer neuesten Studie hat das Labor von Asifa Akthar in Zusammenarbeit mit der von Gerhard Mittler geleiteten Forschungseinheit für Proteomik, beide am MPI-IE in Freiburg, eine Reihe von Workflows zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA und Proteinen entwickelt. „Bisher lag der Fokus oft nur auf den direkten Interaktionen zwischen den Molekülen“, sagt Amol Panhale, der Erstautor der Studie. „Aber mit unseren Bemühungen haben wir den Bereich erweitert. Wir sind in der Lage, das gesamte Netzwerk an Proteinen abzudecken, das Funktionen der RNA reguliert.“ Das Spektrum reicht dabei von komplexen Proteinstrukturen, die direkt oder indirekt an die RNA binden, bis hin zu einzelnen Aminosäuren, die alle gleichzeitig in nur einer einzigen Probe gemessen werden können

Mit ihrer Technik hat das Team ein umfassendes RNA-Protein-Interaktom des Modellorganismus Drosophila melanogaster erstellt und dabei mehr als 1500 direkt RNA-bindende Proteine und fast 2500 sogenannte RNA-assoziierte Proteine erfasst. Interessanterweise finden sich unter den Letzteren eine unerwartete Anzahl von Proteinen, die den Forscherinnen und Forschern bereits aus anderen zellulären Prozessen wie dem Zellstoffwechsel, der Endozytose oder der DNA-Replikation bekannt sind. Da diese Proteine in der Regel nicht an der Proteinbiosysnthese beteiligt sind, deuten diese Ergebnisse auf ein bisher wenig erforschtes Zusammenspiel von   Proteinbiosynthese und anderen Prozessen in der Zelle hin.

Ein hochauflösende Kartierung des RNA-Protein-Interaktoms

Für die meisten identifizierten Proteine, die direkt an die RNA binden, ist nicht bekannt, welcher Abschnitt des Proteins genau mit dem RNA-Molekül in Kontakt tritt. Daher entwickelte das Team im Rahmen ihres Workflows eine Methode mit dem Namen CAPRI (für “Crosslinked and Adjacent Peptides-based RNA-binding domain Identification”), um diese sogenannten RNA-Bindungsdomänen in einem Hochdurchsatzverfahren zu ermitteln. Ihre innovative, auf Massenspektrometrie basierende Methode kombiniert dabei zwei komplementäre Techniken, um gleichzeitig Peptide, die sich in der Nähe RNA befinden, sowie die konkreten Aminosäuren, die mit direkt dem RNA-Molekül in Kontakt stehen, zu analysieren. „Es ist so als würde man aus weiter Ferne ein Boot beobachten, das an der Küste anlegen möchte. Mit CAPRI hat man ein Fernglas dabei, um nicht nur das Schiff selbst, sondern auch die Passagiere und sogar das Seil zu erkennen, mit dem das Boot am RNA-Pier vertäut wird,“ erklärt Amol Panhale die hochauflösende Kartierung des RNA-Protein-Interaktoms mittels CAPRI.

Ein besserer Blick in ein unentdecktes Land

Mit seiner hohen Auflösung bietet der CAPRI-Workflow eine einfache Möglichkeit, RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen, die nach Ansicht der Freiburger Forscherinnen und Forscher zu wichtigen biologischen und medizinischen Fragestellungen beitragen können. So kartierten sie mithilfe von CAPRI mehr als 3.000 Proteinregionen in Drosophila- und in menschlichen Zellen. 40 Prozent der erfassten Regionen erwiesen sich dabei als neue Interaktionsstellen und ein Vergleich zeigte, dass viele von ihnen evolutionär zwischen den beiden Arten konserviert sind.                                     

„Spannenderweise gelang es uns mit CAPRI auch Regionen von sogenannten intrinsisch ungeordneten Proteinen zu identifizieren; also Proteinen, die keine feste oder geordnete dreidimensionale Struktur besitzen. Trotz ihrer ungeordneten Struktur erfüllen diese Regionen wichtige Funktionen, wie z.B. die Bildung von membranlosen Organellen in der Zelle,“ sagt Amol Panhale. In jüngster Zeit wurde darüberhinaus gezeigt, dass Mutationen in diesen sogenannten intrinsisch ungeordneten Regionen Auswirkungen auf viele neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson haben. Die Forscher hoffen, dass CAPRI es Wissenschaftlern weltweit ermöglicht, die Evolution dieser Proteinregionen zu untersuchen und Mutationen bei betroffenen Patienten zu entdecken. Dies, so hoffen die Freiburger Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler, wird möglicherweise in der Zukunft auch neue Therapiewege eröffnen.

 


 

Und jedem Anfang wohnt ein Zauber inne: Neue Methode enthüllt Geheimnisse der Genregulation durch die Analyse von Transkriptionsstartstellen

Die Position, Form und Anzahl der Transkriptionsstartstellen (TSS) spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation. Forscher des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie und Epigenetik (MPI-IE) haben eine neue Methode namens "MAPCap" sowie eine Analysesoftware "icetea" entwickelt, die es ermöglicht, diese Startstellen der Transkription zu erkennen und ihre jeweilige Expression in verschiedenen Gewebe und unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

RNA-Moleküle verbinden die Gene der DNA mit ihren Funktionen in der Zelle. In einem Prozess namens Transkription werden die genetischen Informationen der DNA in kleine, mobile RNA-Nachrichten umgewandelt, die anschließend in die Sprache der Proteine übersetzt wird. Galten RNA-Moleküle lange nur als simple Abschriften und Übermittler des Erbguts, weiß man heute jedoch, dass die fadenförmige RNA auch wichtige Funktionen bei der Regulation der Geneaktivität übernimmt und so auch wesentlich stärker in zelluläre Prozesse eingreift als bisher gedacht.                               

Wo befindet sich der Startblock der Transkription?

Für die Transkriptionsmaschine, ein Komplex aus Enzymen, der RNA-Kopien von Genen erstellt, sind die Gene letztlich nichts anderes als Laufbahnen in einem Leichtathletikstadion. Fast jedes Gen besteht aus mehreren Bahnen, die jeweils unterschiedliche Start- und Endpunkte haben. Die Menge, Länge und auch die Stabilität der RNA hängt davon ab, auf welcher Bahn bzw. an welchem Startblock die Transkriptionsmaschine das Ablesen beginnt. Entsprechend ist die Bahnwahl bzw. die Wahl der sogenannten Transkriptionsstartstelle (TSS) wichtig für die Genregulation.

Am Freiburger Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik hat nun ein Team um Direktorin Asifa Akhtar eine neue Methode mit den Namen MAPCap entwickelt, die die Rolle verschiedener Transkriptionsstartstellen für die Regulierung der Transkription analysiert. „Um die Funktion verschiedener Startstellen in zell- und gewebespezifischen Transkriptionsprogrammen zu verstehen, ist ihre genaue Zuordnung entscheidend. Mithilfe von MAPCap können wir die jeweiligen Startstellen nicht nur genau erkennen, sondern zugleich auch die Veränderungen der Expression der Transkripte quantifizieren,“ erläutert Asifa Akhtar. 

MAPCap steht für “Multiplexed Affinity Purification of Capped RNA” und ist eine einfach durchzuführende TTS-Detektionsmethode, die sowohl in kultivierten Fruchtfliegen- und Säugerzellen als auch in sich entwickelnden Fruchtfliegen angewendet werden kann. Das Vervielfachen der Proben und externen RNA-Kontrollgruppen bei der MAPCap-Methode reduziert die Dauer der Experimente. Für die Analyse der Daten entwickelten die Forscher zusätzlich eine Software mit dem Namen “icetea” (Integrating Cap Enrichment with Transcript Expression Analysis), die es ermöglicht die detektierten Transkriptionsstartstellen sowie die entstandenen Transkripte mit hoher Genauigkeit zu quantifizieren.

Unterschiede zwischen Geschlecht und Stadien 

Die Freiburger WissenschaftlerInnen sind überzeugt, dass die neue Methode Forscher in die Lage versetzt, in den Genomen verschiedener Spezies bisher unbekannte Transkriptionsstartstellen zu entdecken und darüberhinaus auch die Auswirkungen auf Proteine zu vergleichen, die durch den Start der Gentranskription an den verschiedenen TSS entstehen. 

In Fliegenembryonen und -larven entdeckte das Team durch ihre Methode bereits Transkriptionstartstellen, die geschlechtsspezifische oder entwicklungsbedingte Unterschiede aufweisen. „Bei der Mutation von MLE, einem wichtigen Protein für die Regulation des X-Chromosom-Gens, konnten wir eine 1,9-fache Abnahme im Median der X-chromosomalen TSS-Expression bei männlichen Fliegen feststellen. Was uns überraschte, war, dass die Mutation von MLE auch TSS mehrerer Gene mit geschlechtsspezifischen Funktionen betraf, die nicht auf dem X-Chromosom liegen“, sagt Vivek Bhardwaj. Die Forscherinnen und Forscher deuten dies als ein erstes Indiz für eine potentielle, neue Funktion des vom MLE-Gen exprimierten Proteins. 

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